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難培養微生物の利用技術

(2004年『難培養微生物研究の最新技術―未利用微生物資源へのアプローチ―』普及版)

商品コード: B0910

  • 監修: 工藤俊章・大熊盛也
  • 発行日: 2010年2月
  • 価格(税込): 4,104 円
  • 体裁: A5判,265ページ
  • ISBNコード: 978-4-7813-0174-7

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刊行にあたって

 自然界の微生物は99%以上が培養困難または不能な未知の新規かつ多様な微生物から構成されていると考えられる。しかし、従来の微生物研究は単離・培養を基本的な技術としており、培養できないという点からこれら大多数の培養不能な微生物を無視せざるを得なかった。今日、ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)の様な新しい科学技術の発展により培養を介さないで微生物にアクセスする可能性がでてきた。例えば、シロアリ腸内容液を顕微鏡で見ると原生生物やスピロヘータをはじめとして色々な微生物を見ることができる。しかしまだ微生物の分離培養技術は十分ではなくシロアリの腸内の微生物の大半は“アンカルチャブル”な非常に単離培養しにくい微生物であることが分かってきた。そこで、シロアリ腸内容物より直接DNAを抽出して、共生微生物のrRNA遺伝子をPCRにより増幅し、塩基配列を決定して系統解析を行った結果、多数の新種・新属と考えられる微生物群がシロアリ腸内に発生していることが明らかになった。
 従来のパスツール、コツホ以来の伝統的な手法では、栄養源を含有する平板寒天培地にコロニーを形成させ分離・培養された微生物を研究や応用の対象とした。しかし、このような手法で取り扱い可能な微生物種は1%前後にすぎず、例えば土壌微生物でわずか0.3%、海洋微生物で0.001%と言われている。地球上に存在する99%以上の微生物種は従来の技術ではハンドリングできない。この99%以上の微生物にアクセス出来る手段を開発出来れば学問や産業の発展に大きく寄与する。米国では既に難培養微生物を対象としたバイオベンチャーによる有用酵素の探索や生理活性物質、抗生物質探索の試みも展開されつつある。そこで、この様な難培養微生物をハンドリングできる技術の開発が急務となって来た。
 本書では難培養微生物研究の現状と最新技術について最先端の研究に従事されている先生方に執筆をお願いした。第1部「難培養微生物の研究方法」では、環境サンプル中の微生物多様性、微生物群集解析、モニタリング、in situ検出法、DNAマイクロアレイや機能遺伝子のmRNA解析法など最近の難培養性微生物解析技術について、第2部「自然環境中の難培養微生物」では、自然界の色々な環境中に於ける難培養微生物の研究の現状と将来について、第3部「微生物資源としての難培養微生物」では、膨大な未利用資源としての難培養微生物の産業的利用の可能性や系統保存法の開発に関して実際の研究現場の先生方に執筆いただいた。
 これら未利用の難培養微生物資源の開拓・研究は21世紀のバイオ研究や新しい産業の創成にきわめて重要かつ先端的な研究応用分野になることが期待される。
 産業界の方々や若手研究者の方々にとって、本書が参考書として利用されれば幸いである。
(「はじめに」より抜粋)

2004年6月  (独)理化学研究所 中央研究所 工藤環境分子生物学研究室 工藤俊章、大熊盛也

<普及版の刊行にあたって>
 本書は2004年に『難培養微生物研究の最新技術―未利用微生物資源へのアプローチ―』として刊行されました。普及版の刊行にあたり、内容は当時のままであり加筆・訂正などの手は加えておりませんので、ご了承ください。

2010年2月  シーエムシー出版 編集部

著者一覧

工藤俊章   (独)理化学研究所 工藤環境分子生物学研究室 主任研究員
         (現)長崎大学 水産学部 教授
大熊盛也   (現)(独)理化学研究所 バイオリソースセンター 微生物材料開発室 室長
木暮一啓   (現)東京大学 海洋研究所 海洋生態系動態部門 教授
上田賢志   日本大学 生物資源科学部 応用生物科学科 助教授
別府輝彦   日本大学 総合科学研究所 教授
倉根隆一郎   (株)クボタ バイオセンター 理事・所長
         (現)中部大学 応用生物化学科 教授
本郷裕一   (独)理化学研究所 環境分子生物学研究室 基礎科学特別研究員
         (現)東京工業大学 生命理工学研究科 准教授
平石 明   (現)豊橋技術科学大学 エコロジー工学系 教授
金川貴博   (独)産業技術総合研究所 生物機能工学研究部門 複合微生物研究グループ長
         (現)京都学園大学 バイオ環境学部 教授
蔵田信也   (現)日鉄環境エンジニアリング(株) 技術研究室環境バイオグループ グループリーダー
山口進康   (現)大阪大学 大学院薬学研究科 衛生・微生物学分野 准教授
那須正夫   (現)大阪大学 大学院薬学研究科 遺伝情報解析学分野 教授
野田悟子   科学技術振興機構 さきがけ 研究員
         (現)山梨大学 大学院医学工学総合研究部 准教授
江崎孝行   (現)岐阜大学 大学院医学系研究科 再生分子統御学講座 病原体制御学分野 教授
大楠清文   (現)岐阜大学 大学院医学系研究科 再生分子統御学講座 病原体制御学分野 准教授
河村好章   岐阜大学 大学院医学研究科 再生分子統御学講座 病原体制御学分野 助教授
         (現)愛知学院大学 薬学部 微生物学講座 教授
関口勇地   (現)(独)産業技術総合研究所 生物機能工学研究部門 グループ長
鎌形洋一   (独)産業技術総合研究所 生物機能工学研究部門 グループリーダー
         (現)(独)産業技術総合研究所 ゲノムファクトリー研究部門 研究部門長
渡邉一哉   (現)東京大学 先端科学技術研究センター 特任准教授
春田 伸   東京大学 大学院農学生命科学研究科 寄付講座教員
         (現)首都大学東京 理工学研究科 准教授
五十嵐泰夫   (現)東京大学 大学院農学生命科学研究科 教授
加藤千明   (現)(独)海洋研究開発機構 海洋・極限環境生物圏領域 主任研究員
荒川 康   (独)海洋研究開発機構 極限環境生物圏研究センター;東洋大学 大学院工学研究科 応用化学専攻 
竹中昭雄   (独)農業・生物系特定産業技術研究機構 畜産草地研究所 家畜生理栄養部 消化管微生物研究室 室長
         (現)国際農林水産業研究センター 畜産草地領域 領域長
坂本光央   (現)(独)理化学研究所 バイオリソースセンター 微生物材料開発室 協力研究員
辨野義己   (独)理化学研究所 バイオリソースセンター 微生物材料開発室 室長
         (現)(独)理化学研究所 知的財産戦略センター 辨野特別研究室 特別招聘研究員
林 秀謙   (独)理化学研究所 バイオリソースセンター 微生物材料開発室 協力研究員
         (現)前橋工科大学 工学部 生物工学科 講師
中鉢 淳   (独)理化学研究所 工藤環境分子生物学研究室 日本学術振興会特別研究員(SPD)
         (現)(独)理化学研究所 基幹研究所 ユニット研究員
石川 統   放送大学 教養学部 教授
斎藤雅典   (現)東北大学 大学院農学研究科 教授
南澤 究   (現)東北大学 大学院生命科学研究科 生態システム生命科学専攻 教授
長谷部亮   (現)(独)農業環境技術研究所 研究統括主幹
守屋繁春   (現)(独)理化学研究所 基幹研究所 守屋バイオスフェア科学創成研究ユニット ユニットリーダー
伊藤 隆   (独)理化学研究所 バイオリソースセンター 微生物材料開発室 先任研究員
作田庄平   (現)東京大学 大学院農学生命科学研究科 准教授
伊藤卓也   (現)徳島文理大学 薬学部 助教
小林資正   大阪大学 大学院 薬学研究科 天然物化学分野 教授
北垣浩志   (現)佐賀大学 農学部 准教授
北本勝ひこ   (現)東京大学 大学院農学生命科学研究科 応用生命工学専攻 教授

 執筆者の所属表記は、注記以外は2004年当時のものを使用しております。

目次

【第1編 難培養微生物の研究方法】
第1章 海洋性VBNC微生物とその検出法
1. 天然水界中の細菌群集
2. “休眠細胞”はいない
3. なぜ培養できないのか
4. 今後どれだけの細菌が培養できるか
5. おわりに

第2章 難培養微生物の具体例、共生細菌Symbiobacterium thermophilum
1. はじめに
2. トリプトファナーゼ生産菌の探索
3. S.thermophilumが示す新しい分類学的性質
4. 普遍的なSymbiobacterium属細菌
5. 透析を利用したS.thermophilumの純粋培養
6. Bucillusの役割は環境を整えること
7. おわりに

第3章 複合微生物系の難培養微生物新規分離手法と複合微生物系有効活用利用法
1. はじめに
1.1 現在ハンドリング出来る微生物種等には限界がある
1.2 未知の微生物を求めて新大陸の複合生物系へ
1.3 複合生物系プロジェクト
2. ゲルマイクロドロップ・フローサイトメトリー法による難培養微生物の新規分離培養法の開発
2.1 難培養性微生物の分離
2.2 分離・培養した微生物の性質
2.3 まとめ
3. 複合系微生物機能解析探索自動化システム(HTS;High Throughput Screening)の開発
3.1 複合微生物系機能解析システム
3.2 複合微生物系由来の新規生理活性物質の探索
3.3 まとめ
4. 蛍光消光等分子間相互作用を利用した複合生物系の迅速検出法の開発
4.1 蛍光消光現象を利用した特定遺伝子検出
4.2 複合微生物系への適用
4.3 まとめ
5. 石油系化合物分解微生物コンソーシアの培養制御技術の開発
5.1 石油分解微生物コンソーシアの機能強化・向上技術
5.2 フェノール分解微生物コンソーシアの培養制御技術の開発
6. おわりに

第4章 環境サンプルの16S rDNAクローン解析法とT-RELP解析法
1. 16SrDNA解析の目的
2. 16SrDNAクローン解析
2.1 DNA抽出
2.2 PCR増幅
2.3 クローンライブラリーの作成とインサートチェック
2.4 配列決定とphylotypeへの分類、キメラ判定
2.5 系統解析
2.6 多様性の評価
2.7 群集構造の比較
2.8 クローン解析における問題点
3. T-RELP解析
3.1 DNA抽出とPCR増幅
3.2 制限酵素処理
3.3 データ解析と問題点

第5章 キノンをバイオマーカーとして用いる環境微生物群集の解析
1. はじめに
2. キノンの分布とバイオマーカーとしての意義
3. キノン分析法
4. キノン分析の応用
5. データの解釈および数量解析
6. おわりに

第6章 定量的PCR法を用いた難培養微生物のモニタリング
1. 定量的PCR法の概要
2. リアルタイム定量的PCR法
2.1 DNA結合性蛍光色素を用いる手法
2.2 蛍光標識プローブを用いる手法
2.2.1 FRETを利用する蛍光標識プローブ
2.2.2 蛍光色素と塩基との相互作用による蛍光消光を利用するプロ-ブ
2.3 蛍光標識プライマー法
3. 内部標準PCR法
4. 競合的PCR法
5. MPN-PCR法
6. 定量的PCR法の難培養微生物定量への応用

第7章 難培養微生物のin situ検出法
1. はじめに
2. 微生物の現存量測定法
3. 生きている微生物の検出・定量
3.1 蛍光活性染色法
3.2 DVC(Direct viable count)法
3.3 マイクロコロニー法
4. 特定の微生物の検出・定量
4.1 蛍光抗体法
4.2 蛍光in situハイブリダイゼーション(Fluorescence in situ hybridization;FISH)法
4.3 in situ PCR法
5. 省力化・自動化
6. おわりに

第8章 機能遺伝子による解析とそのmRNAの検出
1. はじめに
2. 環境中の機能集団の検出
3. 環境中の機能遺伝子のmRNAの検出
4. モニタリングとsingle cell levelでの検出
5. 窒素固定細菌の検出と解析例
5.1 シロアリ共生系の窒素固定に関わる微生物の解析
5.2 海洋の窒素固定に関わる微生物の解析
6. 硝化と脱窒に関わる微生物の解析例
7. おわりに

第9章 DNAマイクロアレイを用いた環境サンプル中の微生物群集の解析
1. 系統マイクロアレイの作成
2. 土壌のDNAの抽出
3. 遺伝子増幅
4. マイクロアレイとの反応
4.1 結果の解析方法
4.1.1 病原体および特定の機能を持った菌群のScreenig
4.1.2 優位な菌の系統解析
4.1.3 菌種レベルの解析
5. おわりに

【第2編 自然環境中の難培養微生物】
第1章 メタン生成古細菌と嫌気共生細菌―嫌気性廃水処理プロセスを例に―
1. はじめに
2. 嫌気環境下の微生物
3. 嫌気的有機物分解―嫌気共生細菌とメタン生成古細菌との共生―
3.1 メタン生成古細菌
3.2 共生細菌
3.3 その他の微生物
4. 嫌気性廃水処理プロセス
4.1 嫌気性廃水処理プロセスにおける各種共生細菌
4.2 グラニュール汚泥の構造を決定する糸状性細菌
4.3 他の未培養微生物群とそれらを解析するためのアプローチ
5. おわりに

第2章 環境中の多様な石油分解菌
1 はじめに
2 多様な石油分解菌を単離する試み
2.1 標識基質を用いた直接プレート法
2.2 連続培養集積法
2.3 生物膜集積法
3. より多様な石油分解菌を理解するために
3.1 中間代謝産物シェア
3.2 分解促進因子
3.3 細胞間シグナリング物質
4. おわりに

第3章 有機性廃棄物の生分解処理と難培養微生物
1. はじめに
2. 培養法に基づく微生物研究
3. 有機物分解過程への分子生物学的手法の適用
4. 培養を経ない手法による微生物の検出
5. おわりに

第4章 深海極限環境における微生物学的多様性と難培養性微生物
1. はじめに
2. 深海のコールドシープ域における微生物学的多様性と難培養性微生物
2.1 コールドシープ底泥サンプルの回収と分子生態学的解析
2.2 バクテリアにおける微生物学的多様性解析
2.3 アーキアにおける微生物学的多様性の特徴
2.4 コールドシープ環境におけるイオウ循環モデル
2.5 コールドシープ環境の硫酸還元細菌
3. 本当に難培養性?まだ培養に成功していないだけ?
4. おわりに

第5章 家畜と難培養微生物―家畜消化管内微生物研究の最前線―
1. はじめに
2. 培養によらない細菌の検出
3. 家畜消化管内細菌の分子系統解析
4. ルーメン内難培養微生物への分子生物学手法の応用
5. 人工ルーメンとメタゲノム解析

第6章 難培養微生物を含むヒト口腔内細菌叢の解析
1. はじめに
2. ヒト口腔スピロヘータ
3. 歯周病原性細菌の検出・定量
4. 口腔内の微生物群集の構造
5. 新規口腔内細菌(ファイロタイプ)の検出
6. 微生物群集構造解析の新たなアプローチ
7. おわりに

第7章 難培養性細菌を含むヒトの大腸内細菌叢の解析
1. はじめに
2. 16S rRNA遺伝子ライブラリー解析
3. 16S rRNA遺伝子を使用したフィンガープリンティングによる大腸内細菌叢の解析
4. Fluorescent in situ hybridization(FISH)による大腸内細菌叢の解析
5. 特異的プライマーによる検出
6. 機能遺伝子による大腸内細菌叢の解析
7. おわりに

第8章 昆虫の細胞内共生微生物
1. はじめに
2. 菌細胞内共生系
2.1 菌細胞内共生系と栄養要求
2.2 アブラムシの共生細菌Buchnera aphidicola
2.3 Buchneraゲノムの特徴
2.4 一次共生体と二次共生体
2.5 WigglesworthiaとBlochmanniaのゲノム
2.6 今後注目される菌細胞内共生細菌
2.7 宿主菌細胞の役割
3. ゲスト微生物
3.1 Wolbachia pipientisによる宿主の生殖撹乱
3.2 Wolbachiaゲノム
4. まとめと展望

第9章 絶対共生微生物・アーバスキュラー菌根菌
1. アーバスキュラー菌根菌とは何か?
2. アーバスキュラー菌根(AM)菌のライフサイクル
3. アーバスキュラー菌根(AM)菌はなぜ培養できないか?
4. アーバスキュラー菌根(AM)菌の機能解明:遺伝子からアプローチする
5. アーバスキュラー菌根(AM)菌の機能解明:顕微鏡によるアプローチ
6. 遺伝資源としてのアーバスキュラー菌根菌

第10章 植物の内生窒素固定細菌
1. はじめに
2. 根粒菌の生活環
3. 根粒バクテロイドの難培養性
4. 根粒菌の共生モードから単生モードへの切り換えの意味
5. イネ科植物体内の窒素固定エンドファイト
6. 野生のイネ科植物の分離困難な窒素固定細菌共同体
7. 植物体内で培養困難になるAzoarcus属窒素固定エンドファイト

【第3編 微生物資源としての難培養微生物】
第1章 eDNAによる培養困難微生物資源へのアクセス
1. はじめに
2. eDNA、メタゲノム解析とは
3. eDNAとメタゲノム解析による研究実績と内外の研究動向
3.1 新規酵素探索
3.1.1 多糖類分解酵素
(1) セルラーゼ
(2) キシラナーゼ
(3) キチナーゼ
(4) アガラーゼ
(5) アミラーゼ
3.1.2 アルコール、有機酸分解酵素
(1) アルコール酸化還元酵素
(2) 酪酸分解酵素
3.1.3 脂質分解酵素
(1) リパーゼ
3.1.4 タンパク質分解酵素
(1) アルカリプロテアーゼ
3.1.5 難分解性有機化合物分解酵素ほか
3.2 新規生理活性物質探索
4. eDNA研究の技術的課題
4.1 塩基配列ベース研究(eDNA-PCR研究)
4.2 発現ベース研究
4.2.1 eDNA回収法:できるだけマイルドに大きなサイズのDNA断片を得る
4.2.2 BACライブラリーの利用:より大きなDNA断片をクローニングする
4.2.3 進むBACベクターの改良:大腸菌以外の宿主で発現させる
4.2.4 スクリーニング効率を上げる
5. おわりに

第2章 難培養性真核微生物のEST解析―シロアリ腸内の絶対共生性原生生物をモデルとして―
1. 「培養されていない」微生物から遺伝子資源を探す
2. 環境cDNAライブラリー
3. シロアリの共生原生生物
4. 微生物集団からのcDNAライブラリー構築の実際
5. シロアリ腸内共生原生生物群のEST解析
6. 環境cDNAライブラリー的アプローチの問題と将来

第3章 難培養微生物をいかに系統保存化するのか
1. はじめに
2. 難培養微生物とその分離・培養法
3. 牛ルーメン内難培養偏性嫌気性菌の単離・培養
4. ヒト口腔内難培養トリポネーマの単離・培養法の確立
5. 好熱性古細菌の分離・培養
6. 難培養性微生物の系統保存
7. 難培養性原核生物の命名
8. おわりに

第4章 難培養性微生物からの生物活性天然物質の探索
1. はじめに
2. eDNAを用いた放線菌のタイプII型ポリケチド生合成遺伝子の多様性解析
3. eDNA由来の生合成遺伝子を利用した天然物質の生産
4. おわりに

第5章 海綿由来の生理活性物質と共生微生物
1. はじめに
2. 海洋生物由来の医薬品資源
3. 生物活性物質を生産する共生微生物の存在
4. 海洋微生物からの生物活性物質
4.1 分離例1
4.2 分離例2
4.3 分離例3
4.4 分離の応用
5. バイオテクノロジー技術を用いた難培養性共生微生物の利用
6. おわりに

第6章 醸造にかかわる難培養・複合系微生物
1. はじめに
2. 醸造における複合系微生物
2.1 清酒
2.1.1 酒母
(1) 生きもと系酒母
(2) 菩提きもと
(3) 速醸系酒母
2.1.2 もろみ
2.1.3 貯蔵
2.2 焼酎
2.3 ビール
2.4 ランビックビール
2.5 ウィスキー
2.6 ワイン
2.7 シェリーワイン
3. おわりに
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