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【特集】 高難度タンパク質の生産・結晶化・解析技術
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特集にあたって―高難度タンパク質の構造生物学のための技術―
Technologies for Structural Biology of Difficult Proteins
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横山茂之((独)理化学研究所 横浜研究所 生命分子システム基盤研究領域 領域長;東京大学 大学院理学系研究科)
若槻壮市(高エネルギー加速器研究機構 物質構造科学研究所 構造生物学研究センター)
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動物細胞を用いる高難度タンパク質生産と迅速精製技術
High-quality Recombinant Production of Glycoproteins Using Mammalian Expression System
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高木淳一(大阪大学 蛋白質研究所 プロテオミクス総合研究センター 教授)
膜タンパク質、糖タンパク質などのいわゆる高難度ターゲットの高品質な組換え発現・精製には、動物細胞発現系の採用が必須なケースがある。一般にはハードルの高いと言われる動物細胞発現、とくに安定発現系の構築と、それに続くタンパク質の迅速精製のために筆者らが行っている技術開発の現状を概説する。
【目次】
1. はじめに
2. 動物細胞発現系のメリット
2.1 翻訳後修飾
2.2 品質管理は細胞に任せる
3. 動物細胞発現の戦略
4. アフィニティ精製
4.1 アフィニティタグシステムの必要性
4.2 TARGET タグシステム
4.3 経済性とスクリーニングへの応用
5. ターゲットタグを使った細胞外タンパク質発現精製の実例
6. おわりに―公開・供与―
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無細胞系による高難度タンパク質生産
Production of Difficult Proteins by Cell-free Protein Synthesis
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遠藤弥重太(愛媛大学 無細胞生命科学工学研究センター 教授 センター長;(独)理化学研究所 横浜研究所 生命分子システム基盤研究領域)
横山茂之((独)理化学研究所 横浜研究所 生命分子システム基盤研究領域 領域長;東京大学 大学院理学系研究科)
無細胞タンパク質合成法は、結晶構造解析等のための高品質タンパク質大量調製にも用いられるようになってきた。高難度な膜タンパク質とヘテロ複合体は、無細胞タンパク質合成法が威力を発揮する典型例のひとつである。本稿では、大腸菌および小麦胚芽由来の無細胞タンパク質合成技術の現状を紹介する。
【目次】
1. はじめに
2. 無細胞タンパク質合成
3. 大腸菌無細胞タンパク質合成系
3.1 複合体
3.2 膜タンパク質
4. 小麦胚芽無細胞タンパク質合成系
4.1 小麦無細胞系の特性
4.2 タンパク質へテロ会合体の生産と構造解析用試料の調製
4.3 膜タンパク質の生産と調製
4.3.1 プロテオリポソームの調製
4.3.2 プロテオリポソームから膜タンパク質の精製
5. おわりに
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G タンパク質共役受容体(GPCR)の三次元結晶構造解析への試み
Towards Structure Determination for G Protein-coupled Receptor
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小林拓也(京都大学 医学研究科 分子細胞情報学講座 講師)
岩田 想(京都大学 医学研究科 分子細胞情報学講座 教授)
医学、創薬において非常に重要な働きを担うGPCR は、構造生物学にとって高難度タンパク質の一つにあげられる。近年になるまで、GPCR の構造解析が進んでいなかった理由としては、(1)機能を保持した状態で大量に発現し、高純度に精製することが困難なこと、(2)疎水領域が多く、結晶化が難しいこと、(3)結晶性が悪く良好なX 線回折データが得られないこと、があげられる。本稿では、国内、国外のGPCR の三次元結晶構造解析への試みの現況と将来展望について概説する。
【目次】
1. はじめに
2. 酵母を用いたGPCR の安定変異体の作製と大量生産
3. 抗体を用いた結晶化
3.1 マウスへの免疫:リポソーム免疫法の開発
3.2 培養上清からの一次スクリーニング:リポソームELISA 法の開発
3.3 培養上清からの二次スクリーニング:立体構造を認識する抗体のスクリーニング法の開発
4. 脂質キュービック相を用いた結晶化
5. おわりに
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結晶成長の新技術
Novel Technology for Protein Crystallization
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松村浩由(大阪大学 大学院工学研究科 応用化学専攻 准教授)
杉山 成(大阪大学 大学院工学研究科 客員准教授)
安達宏昭((株)創晶 代表取締役社長)
高野和文(大阪大学 大学院工学研究科 准教授)
村上 聡(東京工業大学 大学院生命理工学研究科 教授)
井上 豪(大阪大学 大学院工学研究科 教授)
森 勇介(大阪大学 大学院工学研究科 教授)
最近開発された新しいタンパク質結晶化技術を紹介する。一つは中性子線回折に向けた大型結晶育成技術であり、種結晶を吊り下げて雑晶除去を必要とせずに育成する方法と、大容量ハンギングドロップ法である。これらの方法を用いてHIV-1protease と阻害剤複合体の大型結晶を育成し、中性子線構造解析に成功している。さらに、それらを組み合わせた手法も紹介する。もう一つは、X線回折実験に適した固化アガロースゲル中での結晶育成技術である。結晶に直接接触することなくマウント操作が可能となるため高精度なX線回折データを得ることができる。
【目次】
1. 大型タンパク質結晶育成
1.1 はじめに
1.2 TSSG 法を利用した大型結晶育成
1.3 高難度結晶化タンパク質のTSSG 法を利用した大型結晶育成
1.4 大容量ハンギングドロップ法を利用した大型結晶育成
1.5 TSSG 法と大容量ハンギングドロップ法との組み合わせ技術
2. 固相ゲル中でのタンパク質結晶育成
2.1 はじめに
2.2 アガロースゲル
2.3 固相ゲル中でのタンパク質結晶化
2.4 固相ゲル中育成結晶の品質評価
2.5 固相ゲル中結晶の構造解析
-------------------------------------------------------------------------
宇宙環境を利用した高品質なタンパク質の結晶生成
High-quality Protein Crystal Growth Experiment under Space Environment
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佐藤 勝((独)宇宙航空研究開発機構 有人宇宙環境利用ミッション本部 宇宙環境利用センター 主任開発員)
対流や沈降のない宇宙の微小重力環境を利用することで、結晶の品質が向上することが知られており、タンパク質の3 次元立体構造を解析する上で、有効なツールとして期待されている。本稿では、国際宇宙ステーションの「きぼう」日本実験棟で実施している、「高品質タンパク質結晶生成実験」について紹介する。
【目次】
1. はじめに
2. 宇宙環境での結晶生成
2.1 微小重力環境の効果
2.1.1 対流の抑制
2.1.2 沈降抑制
2.2 微小重力環境効果の予測
3. JEMでの高品質タンパク質結晶生成実験
3.1 実験方法・実験装置
3.2 利用の枠組み
4. これまでの宇宙実験での成果
4.1 プロスタグランジンD合成酵素
4.2 ヒト由来MTH1タンパク質
4.3 ナイロンオリゴマー分解酵素
4.4 セルロース分解酵素
5. おわりに
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高難度タンパク質をターゲットとした放射光ビームライン開発
Newly Developed Beamlines Dedicated to Overcome Difficulties in Protein Crystallography
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平田邦生((独)理化学研究所 播磨研究所 放射光科学総合研究センター)
山本雅貴((独)理化学研究所 播磨研究所 放射光科学総合研究センター)
松垣直宏(高エネルギー加速器研究機構 物質構造科学研究所 構造生物学研究センター)
若槻壮市(高エネルギー加速器研究機構 物質構造科学研究所 構造生物学研究センター)
疾病や障害等の生命現象には、膜タンパク質やタンパク質複合体が重要な役割を担っている。これらタンパク質の立体構造情報は現象の理解に欠かせないものであるが、一方で可溶性の球状タンパク質に比べ発現・精製・結晶化が非常に困難であるという問題がある。より微小で低品質の結晶、あるいは微量しか得られないタンパク質試料から効率的に構造解析を成功に導くための技術開発が求められている。ここでは、ターゲットタンパク研究プログラムで推進している2 本の相補的なマイクロビームビームライン開発の現状と課題を述べる。
【目次】
1. 高フラックスマイクロビームを用いたタンパク質微小結晶構造解析(平田邦生、山本雅貴)
1.1 タンパク質の微小結晶構造解析
1.2 ビームラインの仕様
1.3 集光実験の結果
1.4 集光ビームを利用した実験
1.5 今後の展望
1.5.1 微小結晶のアラインメント
1.5.2 微小結晶のハンドリング
1.5.3 複数微小結晶を用いた構造解析
1.5.4 ユーザの利用支援体制の整備
2. 低エネルギーマイクロビームを用いたタンパク質結晶構造解析(松垣直宏、若槻壮市)
2.1 タンパク質結晶構造解析と誘導体結晶
2.2 軽原子SAD法
2.3 KEK.PF BL.1A:低エネルギーマイクロビームビームラインの開発
2.4 展望
-------------------------------------------------------------------------
新しいX線結晶構造解析技術
New Technique for X-ray Crystal Structure Analysis of Proteins
-------------------------------------------------------------------------
渡邉信久(名古屋大学 シンクロトロン光研究センター 教授 副センター長)
田中 勲(北海道大学 大学院先端生命科学研究院 教授)
従来、構造未知のタンパク質の結晶構造解析では、重原子導入やセレノメチオニン化等、タンパク質や結晶の何らかの修飾が必須であった。筆者らは、タンパク質中に初めから存在するイオウ原子に着目し、長波長X 線と新規結晶マウント法を組み合わせてその微弱な異常散乱効果を利用する方法を開発した。ここでは、これまでに構造解析したもののうち、従来法では解析が困難であった例を2 つ示し、新手法の有効性を紹介する。
【目次】
1. はじめに
2. 長波長X 線の利用
2.1 クロム特性線の利用
2.2 新規結晶マウント法
3. 応用例
3.1 非識別性グルタミルtRNA 合成酵素(ND-GluRS)の構造解析
3.2 putative 4-amino-4-deoxychorismate lyase(TTHA0621)の構造解析
4. おわりに
-------------------------------------------------------------------------
BIO R&D
-------------------------------------------------------------------------
糖鎖クラスター効果を利用したウイルス・毒素類の多目的検出薬の開発
Development of Multitasking Biosensor for Bacteria and Viruses based on Glyco-cluster Effect
-------------------------------------------------------------------------
幡野 健(埼玉大学 大学院理工学研究科 物質科学部門 准教授)
松岡浩司(埼玉大学 大学院理工学研究科 物質科学部門 准教授)
感染症の原因となるウイルスや毒素と特異的に接着する糖鎖を発光性のシロール基をコア部に持つカルボシランデンドリマーへ集積化させた化合物群を合成した。これらの化合物の溶液中の発光強度は、レクチンの存在により大きく変化するため感染症検査薬として有用であることが分かった。さらに、発光色・糖鎖構造の異なるシロール含有デンドリマーの混合物は、レクチンの複数同時検査が可能であることを見出した。
【目次】
1. はじめに
2. 蛍光消光によるレクチン検出試験
3. 蛍光の色調変化による複数レクチンの同時検出
4. 本方法の特徴と将来展望
-------------------------------------------------------------------------
連載 メディカルバイオ・マネージメント(第6回)
-------------------------------------------------------------------------
製薬企業におけるアライアンスの実際
Facts on Pharmaceutical Alliances
-------------------------------------------------------------------------
木曽誠一(田辺三菱製薬(株) 事業開発部 部長)
アライアンスは医薬品の研究開発活動に必須であり、有望な化合物や技術の獲得は製薬企業の成長に欠かせないものとなっている。本稿では、製薬企業の研究開発を取り巻く環境からアライアンスの重要性を述べるとともに、アライアンスの効用を解説する。また、日本の製薬企業を取り上げ、そのアライアンスの意図と成果を考察する。
【目次】
1. 研究開発を取り巻く環境とアライアンスの重要性
2. 研究開発の生産性向上とアライアンスの方向性
3. 競争優位の創薬力の確立とアライアンス
4.ケーススタディ
4.1 武田薬品工業
4.2 大日本住友製薬
4.3 塩野義製薬
5.おわりに
-------------------------------------------------------------------------
BIO BUSINESS
-------------------------------------------------------------------------
アミノ酸の市場
Market of Amino Acid
-------------------------------------------------------------------------
【目次】
1. 概要
2. 用途
2.1 機能性食品
2.2 調味料・甘味料
2.3 飼料
2.4 その他
3. 需要動向
3.1 機能性食品
3.2 飼 料
3.3 その他
4. メーカー動向
5. 価格
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特集にあたって―高難度タンパク質の構造生物学のための技術―
Technologies for Structural Biology of Difficult Proteins
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横山茂之((独)理化学研究所 横浜研究所 生命分子システム基盤研究領域 領域長;東京大学 大学院理学系研究科)
若槻壮市(高エネルギー加速器研究機構 物質構造科学研究所 構造生物学研究センター)
-------------------------------------------------------------------------
動物細胞を用いる高難度タンパク質生産と迅速精製技術
High-quality Recombinant Production of Glycoproteins Using Mammalian Expression System
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高木淳一(大阪大学 蛋白質研究所 プロテオミクス総合研究センター 教授)
膜タンパク質、糖タンパク質などのいわゆる高難度ターゲットの高品質な組換え発現・精製には、動物細胞発現系の採用が必須なケースがある。一般にはハードルの高いと言われる動物細胞発現、とくに安定発現系の構築と、それに続くタンパク質の迅速精製のために筆者らが行っている技術開発の現状を概説する。
【目次】
1. はじめに
2. 動物細胞発現系のメリット
2.1 翻訳後修飾
2.2 品質管理は細胞に任せる
3. 動物細胞発現の戦略
4. アフィニティ精製
4.1 アフィニティタグシステムの必要性
4.2 TARGET タグシステム
4.3 経済性とスクリーニングへの応用
5. ターゲットタグを使った細胞外タンパク質発現精製の実例
6. おわりに―公開・供与―
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無細胞系による高難度タンパク質生産
Production of Difficult Proteins by Cell-free Protein Synthesis
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遠藤弥重太(愛媛大学 無細胞生命科学工学研究センター 教授 センター長;(独)理化学研究所 横浜研究所 生命分子システム基盤研究領域)
横山茂之((独)理化学研究所 横浜研究所 生命分子システム基盤研究領域 領域長;東京大学 大学院理学系研究科)
無細胞タンパク質合成法は、結晶構造解析等のための高品質タンパク質大量調製にも用いられるようになってきた。高難度な膜タンパク質とヘテロ複合体は、無細胞タンパク質合成法が威力を発揮する典型例のひとつである。本稿では、大腸菌および小麦胚芽由来の無細胞タンパク質合成技術の現状を紹介する。
【目次】
1. はじめに
2. 無細胞タンパク質合成
3. 大腸菌無細胞タンパク質合成系
3.1 複合体
3.2 膜タンパク質
4. 小麦胚芽無細胞タンパク質合成系
4.1 小麦無細胞系の特性
4.2 タンパク質へテロ会合体の生産と構造解析用試料の調製
4.3 膜タンパク質の生産と調製
4.3.1 プロテオリポソームの調製
4.3.2 プロテオリポソームから膜タンパク質の精製
5. おわりに
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G タンパク質共役受容体(GPCR)の三次元結晶構造解析への試み
Towards Structure Determination for G Protein-coupled Receptor
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小林拓也(京都大学 医学研究科 分子細胞情報学講座 講師)
岩田 想(京都大学 医学研究科 分子細胞情報学講座 教授)
医学、創薬において非常に重要な働きを担うGPCR は、構造生物学にとって高難度タンパク質の一つにあげられる。近年になるまで、GPCR の構造解析が進んでいなかった理由としては、(1)機能を保持した状態で大量に発現し、高純度に精製することが困難なこと、(2)疎水領域が多く、結晶化が難しいこと、(3)結晶性が悪く良好なX 線回折データが得られないこと、があげられる。本稿では、国内、国外のGPCR の三次元結晶構造解析への試みの現況と将来展望について概説する。
【目次】
1. はじめに
2. 酵母を用いたGPCR の安定変異体の作製と大量生産
3. 抗体を用いた結晶化
3.1 マウスへの免疫:リポソーム免疫法の開発
3.2 培養上清からの一次スクリーニング:リポソームELISA 法の開発
3.3 培養上清からの二次スクリーニング:立体構造を認識する抗体のスクリーニング法の開発
4. 脂質キュービック相を用いた結晶化
5. おわりに
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結晶成長の新技術
Novel Technology for Protein Crystallization
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松村浩由(大阪大学 大学院工学研究科 応用化学専攻 准教授)
杉山 成(大阪大学 大学院工学研究科 客員准教授)
安達宏昭((株)創晶 代表取締役社長)
高野和文(大阪大学 大学院工学研究科 准教授)
村上 聡(東京工業大学 大学院生命理工学研究科 教授)
井上 豪(大阪大学 大学院工学研究科 教授)
森 勇介(大阪大学 大学院工学研究科 教授)
最近開発された新しいタンパク質結晶化技術を紹介する。一つは中性子線回折に向けた大型結晶育成技術であり、種結晶を吊り下げて雑晶除去を必要とせずに育成する方法と、大容量ハンギングドロップ法である。これらの方法を用いてHIV-1protease と阻害剤複合体の大型結晶を育成し、中性子線構造解析に成功している。さらに、それらを組み合わせた手法も紹介する。もう一つは、X線回折実験に適した固化アガロースゲル中での結晶育成技術である。結晶に直接接触することなくマウント操作が可能となるため高精度なX線回折データを得ることができる。
【目次】
1. 大型タンパク質結晶育成
1.1 はじめに
1.2 TSSG 法を利用した大型結晶育成
1.3 高難度結晶化タンパク質のTSSG 法を利用した大型結晶育成
1.4 大容量ハンギングドロップ法を利用した大型結晶育成
1.5 TSSG 法と大容量ハンギングドロップ法との組み合わせ技術
2. 固相ゲル中でのタンパク質結晶育成
2.1 はじめに
2.2 アガロースゲル
2.3 固相ゲル中でのタンパク質結晶化
2.4 固相ゲル中育成結晶の品質評価
2.5 固相ゲル中結晶の構造解析
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宇宙環境を利用した高品質なタンパク質の結晶生成
High-quality Protein Crystal Growth Experiment under Space Environment
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佐藤 勝((独)宇宙航空研究開発機構 有人宇宙環境利用ミッション本部 宇宙環境利用センター 主任開発員)
対流や沈降のない宇宙の微小重力環境を利用することで、結晶の品質が向上することが知られており、タンパク質の3 次元立体構造を解析する上で、有効なツールとして期待されている。本稿では、国際宇宙ステーションの「きぼう」日本実験棟で実施している、「高品質タンパク質結晶生成実験」について紹介する。
【目次】
1. はじめに
2. 宇宙環境での結晶生成
2.1 微小重力環境の効果
2.1.1 対流の抑制
2.1.2 沈降抑制
2.2 微小重力環境効果の予測
3. JEMでの高品質タンパク質結晶生成実験
3.1 実験方法・実験装置
3.2 利用の枠組み
4. これまでの宇宙実験での成果
4.1 プロスタグランジンD合成酵素
4.2 ヒト由来MTH1タンパク質
4.3 ナイロンオリゴマー分解酵素
4.4 セルロース分解酵素
5. おわりに
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高難度タンパク質をターゲットとした放射光ビームライン開発
Newly Developed Beamlines Dedicated to Overcome Difficulties in Protein Crystallography
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平田邦生((独)理化学研究所 播磨研究所 放射光科学総合研究センター)
山本雅貴((独)理化学研究所 播磨研究所 放射光科学総合研究センター)
松垣直宏(高エネルギー加速器研究機構 物質構造科学研究所 構造生物学研究センター)
若槻壮市(高エネルギー加速器研究機構 物質構造科学研究所 構造生物学研究センター)
疾病や障害等の生命現象には、膜タンパク質やタンパク質複合体が重要な役割を担っている。これらタンパク質の立体構造情報は現象の理解に欠かせないものであるが、一方で可溶性の球状タンパク質に比べ発現・精製・結晶化が非常に困難であるという問題がある。より微小で低品質の結晶、あるいは微量しか得られないタンパク質試料から効率的に構造解析を成功に導くための技術開発が求められている。ここでは、ターゲットタンパク研究プログラムで推進している2 本の相補的なマイクロビームビームライン開発の現状と課題を述べる。
【目次】
1. 高フラックスマイクロビームを用いたタンパク質微小結晶構造解析(平田邦生、山本雅貴)
1.1 タンパク質の微小結晶構造解析
1.2 ビームラインの仕様
1.3 集光実験の結果
1.4 集光ビームを利用した実験
1.5 今後の展望
1.5.1 微小結晶のアラインメント
1.5.2 微小結晶のハンドリング
1.5.3 複数微小結晶を用いた構造解析
1.5.4 ユーザの利用支援体制の整備
2. 低エネルギーマイクロビームを用いたタンパク質結晶構造解析(松垣直宏、若槻壮市)
2.1 タンパク質結晶構造解析と誘導体結晶
2.2 軽原子SAD法
2.3 KEK.PF BL.1A:低エネルギーマイクロビームビームラインの開発
2.4 展望
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新しいX線結晶構造解析技術
New Technique for X-ray Crystal Structure Analysis of Proteins
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渡邉信久(名古屋大学 シンクロトロン光研究センター 教授 副センター長)
田中 勲(北海道大学 大学院先端生命科学研究院 教授)
従来、構造未知のタンパク質の結晶構造解析では、重原子導入やセレノメチオニン化等、タンパク質や結晶の何らかの修飾が必須であった。筆者らは、タンパク質中に初めから存在するイオウ原子に着目し、長波長X 線と新規結晶マウント法を組み合わせてその微弱な異常散乱効果を利用する方法を開発した。ここでは、これまでに構造解析したもののうち、従来法では解析が困難であった例を2 つ示し、新手法の有効性を紹介する。
【目次】
1. はじめに
2. 長波長X 線の利用
2.1 クロム特性線の利用
2.2 新規結晶マウント法
3. 応用例
3.1 非識別性グルタミルtRNA 合成酵素(ND-GluRS)の構造解析
3.2 putative 4-amino-4-deoxychorismate lyase(TTHA0621)の構造解析
4. おわりに
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BIO R&D
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糖鎖クラスター効果を利用したウイルス・毒素類の多目的検出薬の開発
Development of Multitasking Biosensor for Bacteria and Viruses based on Glyco-cluster Effect
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幡野 健(埼玉大学 大学院理工学研究科 物質科学部門 准教授)
松岡浩司(埼玉大学 大学院理工学研究科 物質科学部門 准教授)
感染症の原因となるウイルスや毒素と特異的に接着する糖鎖を発光性のシロール基をコア部に持つカルボシランデンドリマーへ集積化させた化合物群を合成した。これらの化合物の溶液中の発光強度は、レクチンの存在により大きく変化するため感染症検査薬として有用であることが分かった。さらに、発光色・糖鎖構造の異なるシロール含有デンドリマーの混合物は、レクチンの複数同時検査が可能であることを見出した。
【目次】
1. はじめに
2. 蛍光消光によるレクチン検出試験
3. 蛍光の色調変化による複数レクチンの同時検出
4. 本方法の特徴と将来展望
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連載 メディカルバイオ・マネージメント(第6回)
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製薬企業におけるアライアンスの実際
Facts on Pharmaceutical Alliances
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木曽誠一(田辺三菱製薬(株) 事業開発部 部長)
アライアンスは医薬品の研究開発活動に必須であり、有望な化合物や技術の獲得は製薬企業の成長に欠かせないものとなっている。本稿では、製薬企業の研究開発を取り巻く環境からアライアンスの重要性を述べるとともに、アライアンスの効用を解説する。また、日本の製薬企業を取り上げ、そのアライアンスの意図と成果を考察する。
【目次】
1. 研究開発を取り巻く環境とアライアンスの重要性
2. 研究開発の生産性向上とアライアンスの方向性
3. 競争優位の創薬力の確立とアライアンス
4.ケーススタディ
4.1 武田薬品工業
4.2 大日本住友製薬
4.3 塩野義製薬
5.おわりに
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BIO BUSINESS
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アミノ酸の市場
Market of Amino Acid
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【目次】
1. 概要
2. 用途
2.1 機能性食品
2.2 調味料・甘味料
2.3 飼料
2.4 その他
3. 需要動向
3.1 機能性食品
3.2 飼 料
3.3 その他
4. メーカー動向
5. 価格
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